Sono mesi che scriviamo sui tamponi e sulla tecnologia PCR, crediamo che i tempi siano maturi per scrivere qualcosa in più che forse potrà farvi orientare meglio tra le teorie dei vari virologi o presunti tali. L'argomento è ostico ma crediamo che ognuno possa, e debba, farsi un'idea propria. Vorremmo andare al nocciolo della questione a costo di addentrarci in dettagli tecnici, ma viceversa sarebbe impossibile farci capire e farvi capire perchè i numeri dei positivi al Covid conteggiati giornalmente soffrano di un grave “peccato originale”.
Al fine di contenere e monitorare l’andamento di una epidemia, il parametro che più ci interessa è ovviamente la “contagiosità”, cioè quella capacità di un microrganismo patogeno di trasferirsi da un soggetto ad un altro.
Al momento l’unico strumento che stiamo usando per valutare questo aspetto è il tampone e seguente analisi Real Time PCR, applicando di fatto l’equazione:
POSITIVITA’ AL TAMPONE = SOGGETTO CONTAGIOSO
considerando dunque la positività al tampone requisito unico e sufficiente a stabilire se un soggetto è contagioso.
E’ corretto scientificamente questo comportamento?
La tecnologia PCR, che abbiamo già discusso in precedenza, è una tecnica strumentale usata per vari scopi, ma di per sè NON è un test diagnostico. Può essere un elemento molto utile in una diagnosi, a condizione che si abbia un "riferimento" con cui comparare i risultati.
In questo studio pubblicato su Lancet
gli autori ci dicono: ”che tutti i ricercatori vanno a stimare per quanto tempo un soggetto può essere ritenuto contagioso andando a ricercare l’ RNA virale nei campioni. Finchè ritrovano rna nei campioni considerano il soggetto contagioso, ma in realtà definire un soggetto “contagioso” è un processo molto laborioso che NON può basarsi solo sulla rilevazione di Rna virale.
Infatti per molti virus respiratori ( Sars, Mers, influenza ) è ben noto il fatto che l’ rna virale può essere rilevato molto oltre la fine dell’infezione.
Nel caso del morbillo, ad esempio, il virus può essere rilevato anche 6-8 settimane dopo la scomparsa del virus vitale.
Il sistema immunitario degrada i virus rompendo il loro involucro o aggregando più particelle virali, ma l’acido nucleico viene eliminato lentamente nel tempo."
In un altro articolo Tom Jefferson scrive:
“La PCR è un test molto sensibile, e ciò significa che rileva anche la più piccola frazione di un virus che sta cercando, amplificando il campione milioni di volte. In ogni caso, un frammento non è un virus intero, capace di replicarsi e infettare altri esseri umani. E’ solo una piccola parte della struttura virale ciò che viene rilevato dai primer della PCR, non l’intero virus. Solo virus interi possono infettarci.
In aggiunta il numero di cicli di amplificazione necessario per raggiungere un risultato positivo è raramente riportato. Noi sappiamo che questa è un’informazione vitale per interpretare il risultato. Un alto numero di cicli può rilevare piccoli frammenti e dare risultato positivo, ma un basso numero di cicli è senz’altro un elemento più giusto per identificare i soggetti contagiosi che richiedono la quarantena.”
Ogni ciclo di PCR raddoppia la quantità del campione.
Dunque il numero di cicli di PCR necessario a far apparire fluorescenza ( e dunque positività) è un'informazione vitale, senza la quale non è possibile fare valutazioni cliniche ed epidemiologiche, eppure tutti i risultati che vengono diffusi omettono di darci questa informazione.
Allo scoppio della pandemia non era disponibile ovviamente una tecnica certificata per rilevare il Sars-Cov-2, dunque si è proceduto a diramare le linee guida per autorizzare in “emergency use” (EUA) l’uso dei saggi relativi al covid, trovate per esempio le specifiche USA a questo link
In questo testo troviamo alcuni dettagli fondamentali.
1- il testo specifica che il test funziona con 3 primer, 2 relativi al nucleocapside ( N1 specifico per il Sars-Cov-2 e N3 generico invece per i coronavirus ) e l’ultimo specifico per un gene che codifica per una proteina spike specifica del Sars-Cov-2.
2- Il test viene eseguito scegliendo una Ct ( Ciclo Soglia, è il ciclo della reazione di PCR scelto come riferimento ) estremamente alta, nello specifico 39 cicli, in pratica tutto lo spettro della PCR. Vale a dire che il test darà risultato positivo per ogni segnale di fluorescenza che appare nei primi 39 cicli.
3- Sebbene un eventuale virus di Sars-Cov-2 contenga gli elementi per dare positività a tutti e 3 i primer presenti nel test, poichè ovviamente possiede tutte e 3 le porzioni geniche che il test cerca, dalla tabella su come interpretare i dati apprendiamo che anche se solo 1 primer è positivo, il test da come esito la positività, e già questo è molto strano perché se nel campione fosse presente un virus vitale tutti e 3 i primer dovrebbero dare positività.
Dunque così funziona un test ( negli USA ), se rileva in un tampone, entro 39 cicli, uno di quei 2 pezzi di genoma, da positività. Questo vuol dire contagiosità?
Ma 39 cicli è praticamente il massimo numero di cicli a cui si può spingere la PCR, parliamo di numeri molto grandi, talmente grandi che è impossibile considerare uguali ( e ugualmente positivi=contagiosi ) una positività emersa al 25° ciclo ed una al 38°, è evidente che il secondo campione contiene una carica virale praticamente nulla.
Ma allora come facciamo a interpretare questi risultati?
In uno studio di agosto
Tom Jefferson ci conferma che non c’è uno standard, non esiste valore di Ct di riferimento che ci permetta di dire che al di sotto di tale valore il soggetto è contagioso, al di sopra invece no.
Solo un breve cenno, come vedete dal grafico sottostante il Ct é il punto in cui la curva di fluorescenza incontra la linea di Threshold. Questa linea è posizionata in automatico dal software ma può essere spostata dall'operatore, e conferisce il significato al test.
Non esistendo un parametro viene analizzato tutto lo spettro della PCR, rilevando dunque positività anche totalmente non contagiose.
Lo studio rileva la necessità di eseguire uno studio multi-laboratorio per cercare di correlare la Cycle Threshold al grado di contagiosità, ma al momento manca e purtroppo i vari laboratori nei vari studi, quando si parla di positivi, non rivelano il numero di cicli in cui è stata rilevata la positività, rendendo impossibile per i ricercatori esterni fare considerazioni in merito.
Al momento, dunque,Tom Jefferson afferma che “Definire un livello soglia predittivo di contagiosità dovrebbe essere fattibile ed è necessario per poter fare diagnosi di virus respiratori usando i test molecolari.”
Ricordiamo che il rilevamento del virus vitale si fa con coltura in vitro del campione che ha dato positività. Solo se c’è crescita virale si può supporre che il campione riveli “contagiosità”.
In un’altra review di giugno
Ci si pone la questione : “è possibile distinguere un positivo che è contagioso da uno che non lo è?”
"Esaminando 79 studi abbiamo rilevato che sebbene gli autori riscontrassero Rna virale per un tempo molto prolungato ( anche 83 giorni), i virus vitali sono stati riscontrati al massimo dopo 8 giorni dalla fine dei sintomi. Bullard e Al hanno infatti rilevato nessuna crescita virale in campioni con una Cycle Threshold superiore a 24 oppure da campioni prelevati 8 giorni dopo la scomparsa dei sintomi, anche tra i casi con un esordio con alta carica virale. "
Un'altra conferma della nostra analisi ci viene dalle dichiarazioni di Roberto Rigoli, primario del reparto di microbiologia di Rovigo, che trovate a questo link
«Dei 60mila tamponi effettuati – spiega Rigoli – 210 sono risultati positivi; ma 199 di essi lo erano in maniera molto modesta, tanto che abbiamo dovuto amplificare molto il “segnale” per trovare i virus….
Hanno dovuto amplificare molto il segnale? A quanti cicli hanno rilevato la positività?
Ma il nostro obiettivo dovrebbe essere stabilire la potenziale contagiosità di un soggetto, non quello di rinvenire a qualunque costo tracce di rna virale, dunque perché amplificare così tanto il segnale se l'evidenza scientifica ci dice che oltre un certo numero di cicli il rischio di infettività è praticamente nullo?
Perché non si è provveduto subito a fare uno studio che potesse fornire un indice di riferimento che potesse essere applicato in tutti i laboratori in modo uniforme e invece si è lasciati liberi i ricercatori di "amplificare" a piacimento i parametri col risultato che con tutta probabilità una grossa fetta dei "positivi asintomatici" sono soggetti assolutamente sani e non infettivi?
Tom Jefferson afferra il nocciolo della questione quando afferma che...
"un approccio binario SI/NO all’interpretazione della PCR non validata da coltura virale darà origine a falsi positivi con la reclusione di un grande numero di persone che non sono più infette"
Sarebbe come se un test per il colesterolo rispondesse solo Alto o Basso!
In assenza di un valore sarebbe impossibile per il medico intraprendere qualsivoglia azione terapeutica.
Se un uso così "alla leggera" dei tamponi si poteva giustificare nella fase iniziale dell'epidemia, quando fra l'altro la carica virale media era decisamente più alta e i test erano effettuati solo su soggetti sintomatici, oggi appare scientificamente insensato un uso così indiscriminato su soggetti totalmente asintomatici, peraltro senza avere idea di che valore di carica virale ricercare per poter attestare una effettiva contagiosità del soggetto.
Kary Mullis affermava che con la PCR, amplificando, rendi positiva anche l'acqua.
Cos’è, o cosa dovrebbe essere un test? Dovrebbe essere qualcosa che aiuti un medico a formulare una diagnosi o più in generale a capire lo stato di salute dei suoi pazienti, non di certo qualcosa che sostituisca il medico e che gli inponga una diagnosi anche al di là di evidenti contraddizioni cliniche.
È possibile che un medico possa avallare una diagnosi fatta da un dispositivo senza neanche vedere il paziente? Siamo alla fine della medicina clinica?
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